エバネセント照射及び蛍光に基づく分子診断システム

专利摘要:
照射検出システムは、励起放射線源及び関連の放射線処理装置と、放射線処理装置からの励起放射線をサンプルの分析領域上へ焦点合わせするためのフォーカシング装置とを有する。放射線収集装置は、当該励起に起因したサンプルの分析領域からの放射線を収集し、検出器は、この収集した放射線を検出する。焦点合わせされた励起放射線は、サンプルにおいてエバネセントにある励起ラインを有する。これにより、ライン走査の効果（分析時間短縮）とエバネセント励起の効果（背景信号低減）とが組み合わされ、これにより、治療用途のポイントについての上昇した測定速度及び精度が実現可能となる。
公开号:JP2011511287A
申请号:JP2010544827
申请日:2009-01-26
公开日:2011-04-07
发明作者:デルク；ジェイ；ダブリュ クルンデル；ヘルペン；マールテン；エム；ジェイ；ダブリュ ファン；マリウス；アイ ボアムファ
申请人:コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ；
IPC主号:G01N21-64

专利说明:

[0001] 本発明は、特に分子診断学の分野における照射検出システム及び方法に関する。]
背景技術

[0002] 検出システムに用いられる照射の１つの例は、蛍光であり、蛍光検出の使用の例は、核酸検査（ＮＡＴ）である。これは、感染症を引き起こすバクテリア及びウィルスのような病原体のＲＮＡ表記レベル又は識別を判定するための、病気に対する遺伝性素因を検出するための分子診断学における核心要素である。]
[0003] 蛍光の検出は、特定の目標ＤＮＡサンプルの存在の定性的判定のためと、サンプルに存在するＤＮＡの量の定量的判定のためとの双方につき用いることができる。この発明は、蛍光を検出するために用いられる装置及び使用方法に関する。]
[0004] 代表的分子診断実験において、生体試料は、遺伝子又は蛋白質などの或る特定の生物学的構成部（「目標」）の検出のために検査される。これは、固体表面に付けられる捕捉プローブに当該目標の選択的結合（交配として知られている）の発生を検出することによって行われる。この交配ステップの後は、通常は、洗浄ステップが続き、未結合の全ての目標分子は、洗い流され、最後に検出ステップが行われる。]
[0005] 検出は、目標分子に付けられた蛍光標識の蛍光検出に基づいている。蛍光検出は、非常に感受性が高く、表面特異性があり、生物学的背景を最小限にするようにする必要がある。理想的には、蛍光検出は、当該処理が時間効率が高いままとしながら、単一蛍光標識検出が可能なものである必要がある。]
[0006] 近い将来、かかる検出は、診断のために建設された病院や研究施設の外で行われる必要がある。これには、当該装置が比較的に短い時間で高感度測定が可能である必要がある。]
[0007] バイオセンサにおける蛍光検出の限界の１つは、この生物学的背景信号である。代表的な実験において、表面に結合した分子の蛍光を検出する必要がある。しかしながら、当該表面の近傍における生体構成部は、大きな背景信号を発生する可能性がある。よって、比較的に長い測定時間が、当該背景による補償を行うのに必要とされる。この問題を軽減する標準的方法は、共焦フィルタリングを用いて、小さいボリュームからの励起を、使用する検出器上へ画像化させるようにすることである。]
[0008] しかしながら、共焦光学システムの使用に伴う問題は、ここでも、検出処理の長さである。その理由は、スポット焦点は、確実性及び感受性を確実なものとするために当該サンプルの関心領域にわたりスキャンされる必要があるからである。]
[0009] この問題に対する１つの提案される方策は、ライン走査蛍光検出を実現することである。焦点ラインは、当該サンプルにわたりスキャンされるので、検出時間を短縮することができる。しかしながら、共焦フィルタリングは、当該励起線の軸に沿った方向において最適ではない。これは、検出された表面蛍光が比較的に大なる背景信号により影響を受け当該感受性が低下するという直接的な結果を奏する。]
発明が解決しようとする課題

[0010] 本発明の目的は、治療診断について使用に供する分析システム及び方法であって、高測定速度を実現することができる一方で感受性及び／又は表面特異性の大幅な損失の伴わないものを提供することである。]
課題を解決するための手段

[0011] 本発明は、独立請求項により規定される。従属請求項は、有利な実施例を規定する。]
[0012] 本発明によれば、照射検出システムが提供される。]
[0013] 本発明によるシステムにより、高速ライン走査検出の強度が感受性の損失を被ることなく実現される。高速スキャン速度のためのライン焦点の使用は、ライン検出における共焦点性（confocality）を生じさせる。よって、このタイプの検出の感受性が減る。この効果を補償するために、エバネセント励起が導入される。エバネセント励起の使用は、表面特異性を増大させるので、検出の感度増加が達成される。したがって本発明は、ライン走査（分析時間短縮）の効果とエバネセント励起（背景信号低減）の効果とを組み合わせる。これにより、ここでこれまで概説したように治療診断用途の点が可能となる。]
[0014] 関連の放射線処理装置は、好ましくは、環状ビーム形状を発生するためのビーム整形変換器を有するのが良い。この環状ビーム形状は、励起放射線により当該サンプルのエバネセント励起を発生するために用いることができる。特に、当該ビームが焦点合わせさせられるとき、当該光が臨界角を超える当該サンプルに対する入射角を有する場合、当該サンプルにおける全内部反射となり、近接場エバネセント光だけが、当該サンプルを励起するよう当該サンプルに入ることになる。ビーム整形素子は、例えば、励起放射線源の出力において平行平面円形断面波面から環状ビーム形状を発生することができる。但し、断面は、円形である必要はなく、例えば楕円形、矩形又は正方形とすることができる。実際、以下に説明されるようにエバネセント励起を得るために臨界角の要件が満たされている限り、いずれの形状も適うものとなる。]
[0015] 関連の放射線処理装置は、好ましくは、励起ラインに対してフォーカシング装置によりマップ化される環状ビームからビーム形状を発生するためのライン形成素子も有するのが良い。これにより、２Ｄサンプル領域にわたりスキャンを実施するように唯一の方向において走査が可能となるようライン照射が規定される。ライン形成素子は、例えば、円柱レンズ又は位相板を有することができる。]
[0016] 放射線収集装置は、好ましくは、当該サンプルからのルミネセンス放射線、すなわち蛍光放射線及び／又は燐光放射線を収集するためのものとするのが良い。最も感度が高く瞬間的な過程に基づいているので、蛍光放射線検出が用いられるのが好ましい。]
[0017] 本システムは、励起することのできるサンプルを分析するために用いることができる。このようなサンプルは、当該表面に付けられる場合に、固体、液体又は気体のあらゆる種類の材料を含む。好ましくは、当該サンプルは、分析すべき化学物質を輸送又は包含することのできる場所又は室部の形態の分析表面を有する。このような室部は、全てのボリュームの反応容器となりうるものである。好ましくは、本システムは、例えばＤＮＡ又はＲＮＡのようなオリゴ又はポリヌクレオチドの分析システムを有する。このようなシステムは、かかる材料の複製に基づいたものを含み、例えばポリメラーゼ連鎖反応複製又は他の複製技術を含む。]
[0018] フォーカシング装置及び放射線収集装置は、励起／収集レンズを共有することができる。これにより、病院の外部の領域における安定性及び使用の観点で望まれるシステムを簡単にする。製造コストも減少することになる。]
[0019] 本発明によれば、照射検出システムを用いてサンプルからの分析放射線を測定する方法も提供される。この方法は、とりわけ当該装置に関連してここで上述したような利点を奏する。]
図面の簡単な説明

[0020] 以下、本発明の具体例を、添付図面に基づき詳細に説明する。
エバネセント励起の原理を示すために用いられる図。
本発明の分析装置を示す図。
エバネセント場を発生するために当該光をどのように整形するかを示す図。
図２のシステムにおける使用に供されるビーム整形装置の第１の例を示す図。
図２のシステムにおける使用に供されるビーム整形装置の第２の例を示す図。] 図２
実施例

[0021] 本発明は、ライン走査検出をエバネセント励起と組み合わせる放射線分析装置及び方法に関する。エバネセント励起を用いることにより、表面特異性が大きくなるので、蛍光検出の感度上昇が達成され、これにより、高速ライン走査手法を採用することができる。]
[0022] 先ずエバネセント励起の原理を図１を参照して説明する。この例において、放射線は、光学的放射線すなわち光である。検出される放射線は、蛍光放射線である。当業者であれば、ＵＶ放射線のような他のタイプの放射線を用いてもよいことが分かる筈である。] 図１
[0023] レーザの形態の放射線励起源は、高屈折率媒体ｎ１（例えばガラス）から低屈折率媒体ｎ２（例えば水）に焦点合わせさせられるレーザビーム１０を提供するために用いられる。臨界角θ０よりも小さい角度については、光は媒体ｎ２の中へ透過させられることになる。しかし、ビーム整形装置１２は、媒体ｎ２の中へ光が透過されないような入射ビームの中央部を遮蔽するために用いることができる。これは、媒体ｎ２のバルク励起を除去する。臨界角θ０よりも大きい角度について、全内部反射は２つの媒体の界面で生じ、エバネセント波は、伝搬距離（ｚ）の関数としての減衰場振幅Ｉ（Ｚ，θ１）により低屈折率媒体ｎ２の中へと伝搬しうる。このエバネセント波は、ｚ方向において急に減衰していくので、これは、ｎ１の層とｎ２の層との間の界面の表面の近くに存在するそうした物体又は分子のみを探求するために用いることができる。]
[0024] （短波長）レーザによる励起によって、蛍光分子は、全ての方向において光の放射を開始することとなる。蛍光の光の波長は、励起波長よりも長いものとなる。]
[0025] この例の構成におけるビーム整形装置は、蛍光波長については透明となるよう構成されこれにより集光効率を最大にする中央ダイクロイックマスクとすることができる。]
[0026] 図２は、本発明の例の蛍光スキャナの基本構成部を示している。検査すべきサンプル１４は、基板１６によってマイクロ流体部分を形成する所与のボリュームの中へ限定される。レンズは、以下に説明するような浸漬液１７を含む。レーザのような線源により発生された励起光１０は、蛍光を励起するために用いられる。この光は、光学的装置、この例では、ビーム変換素子１８及びライン形成素子２０（円柱レンズ又は位相板）を有する装置により処理される。] 図２
[0027] 処理された励起光は、ダイクロイックミラー２２によりサンプルへ差し向けられるが、ビームスプリッタを用いることができる。]
[0028] 励起光は、その後、サンプルに対して動くことのできる励起レンズ２６によってサンプルに焦点合わせさせられる。]
[0029] （サンプルに供給されたエバネセント励起光の結果としての）誘導された蛍光は、集光レンズ（この例では励起レンズ２６と同じ構成部）によって集光され、検出器２８に向かうよう方向づけられる。]
[0030] 反射レーザ光（全内部反射光）は、ダイクロイックミラー又はビームスプリッタ２２により再び反射させられるのに対して、蛍光輝度は、ミラー／ビームスプリッタを透過させられる。]
[0031] 帯域通過フィルタ３０は、励起光の阻止をなすためのさらなるフィルタリングを規定し、フィルタ処理された光は、サンプルを検出器２８上へと画像化する画像形成レンズ３２により検出器２８上に焦点合わせさせられる。数多くのタイプの検出器を用いることができ、例えば光電管倍増器及びアバランシェフォトダイオード検出器がある。画素化された検出器を用いることができる。]
[0032] 図２は、ビーム整形素子１８を透過する前（３２）と後（３４）の励起光の強度特性を示している。励起光の強度特性は、円形平行平面波面から環状断面へ変換される。当該光環体の寸法は、レンズ２６の物理的寸法と整合させられており、光は、レンズ２６を透過した後に生体サンプル媒体１４においてエバネセントになるようにしている。] 図２
[0033] 光は、全光学システムにより基板／生体サンプル表面上に焦点合わせさせられる。]
[0034] ライン形成素子２０（円柱レンズ／位相板）は、一方向（例えば当該円柱レンズのアクティブ方向）において当該波面の伝搬を乱すことにより、小さいスポットから光の焦点を変化させる。そして、レンズ２６の焦点面における元のスポットは、線になる。この線は、１つの方向に限定させられた回折であり、その長さは、円柱レンズ／位相板２０により発生される発散／収束により与えられる。]
[0035] 円柱レンズの例では、当該環状リングは、円柱レンズの焦点距離に等しい距離でラインに変換される。レンズと焦点距離との間で、光学的断面の形状は、楕円形リングを経て、環状リングからラインへと連続した変遷となる。円柱レンズは、円柱レンズ２０からフォーカシングレンズ２６への距離よりも非常に長い焦点距離を有する。したがって、フォーカシングレンズに入るときのビームの形状は、少し楕円形の環状リングとなる。]
[0036] パラメータとして所望のライン幅（フォーカシングレンズにより作られるようなもの）を採用すると、円柱レンズの強度（焦点距離）、暗黙的にはそれにより導入される角度偏差を計算することができる。この偏差は、例えば、数度のオーダでしかないものである。]
[0037] したがって、円柱レンズは、ライン形成素子として機能するが、光信号は、当該ラインが形成される前に（フォーカシングレンズによって）さらに処理される。フォーカシングレンズの出力は、サンプル表面でフォーカスされたラインである。]
[0038] ラインの使用は、サンプルの２次元領域をカバーするために唯一の方向における走査を可能にする。このラインは、例えば、０．７ミクロン前後の長さと、０．７ミクロン前後の回折限定された幅とを有することができる。検出時間を短縮することができ、これに加え又はこれに代えて、走査速度を低下させることができる。走査速度の低下は、特にサンプルが動かされているときに望ましい。何故なら、対応の加速は、サンプルのマイクロ流体特性を阻害する可能生があるからである。]
[0039] 図２に示される実施例において、円柱レンズ／位相板２０は、ダイクロイックミラー２２と励起ビームを変換する光学素子１８との間に配置される。実際には、円柱レンズ／位相板は、その代わりとして、ダイクロイックミラー２２とレンズ２２との間又は光学素子１８の前に配置することができる。ビーム変換器１８は、変化する位置に配置されるものとしてもよい。但し、ダイクロイックビームスプリッタの上流に置くことが好ましい。何故なら、その場合には、発生される蛍光を、当該ビーム変換器により影響を受けることなく集光することができるからである。] 図２
[0040] 励起ラインの光場は、生体サンプル媒体においてエバネセントであるとともに、基板／生体サンプル表面に厳密に焦点合わせさせられる。結果として、これは、基板／生体サンプル表面において蛍光色素分子のみを選択的に励起することとなる。]
[0041] 反射した励起光（基板／生体サンプル表面からの光）は、フォーカス及び／又はトラッキングフィードバックループのために用いることができる。この第２の光路は、図２には示されておらず、詳細は説明しない。というのは、励起／集光レンズ２６の慣例的なアクティブフォーカス及びトラッキング装置は、アクティブフォーカス／トラッキングとの組み合わせで本発明のエバネセントライン励起を用いることと組み合わせて用いることができるからである。] 図２
[0042] 円柱レンズ２０の強度、又は位相板により生じる波面歪は、好ましくは、当該ラインの横方向の延長がレンズの領域内にあり、すなわち波面歪が所望の値を下回ったままでいるように限定されるのが良い。]
[0043] エバネセント励起領域を形成するため、浸液系レンズが用いられるのが好ましい。固体浸漬タイプのレンズを用いることができ、これは「近接場」としても知られており、或いは液体浸漬タイプでも可能である。]
[0044] 基板／生体サンプルインターフェースにおけるエバネセント場を得るための条件は、



によって与えられ、この際、レンズ屈折率（及び液体浸漬の場合における浸漬液の屈折率）は、当該基板の屈折率以上であるという条件を伴っている。同じ条件から、レンズ２６の開口数（ＮＡ）が次式を満たさなければならないことが明らかとなる。]
[0045] レンズの幾何学的構造を考慮すると、最小角度状態（αｍｉｎ）は、浸漬レンズに当たる光の環状リングの最小内側半径に変わる。これは図３に示される。] 図３
[0046] 蛍光集光のため、浸漬レンズの最大ＮＡが用いられる。]
[0047] 図４は、円形ビーム輪郭３２を環状ビーム３４に変換する１つの態様を詳しく示している。この光学素子は、軸４０について円対称性を有し、角度のある入射面を用いることによりビームスプリット機能を提供する。この素子は、円錐形の入出力表面を有し、これらは、軸４０に対して当該光ビームを発散させそして収束させるために用いられる。この入力表面は、当該素子のボディ内へ突き出るとともに、出力表面は、当該素子のボディから突き出る。この構成は、励起光の全てが用いられるので効率的な光変換をなし、場合によっては、より高強度のエバネセント場を発生する。結果として得られる環体のパラメータは、当該光学素子の特性角度α及びβと、その長さ及び当該入力ビームの半径により決まる。] 図４
[0048] 図５は、図４の光学素子の変形例を示している。この光学素子は、２つの構成部に分割される。入力構成部は、円錐形入力表面（当該素子のボディ内へと突出する）と平面状出力表面とを有し、出力構成部は、平面状入力表面と円錐形出力表面（当該素子のボディから突出する）とを有する。] 図４ 図５
[0049] 図５に示されるように、結果として得られる環体の寸法は、２つの部分の間の距離を変更することにより調整可能である。] 図５
[0050] 本発明は、光の環体を得るための上述した方法に限定されるものではない。他の方法、例えば位相板、環状絞り又はダイクロイックリングも用いることができる。代替例として、シュバルツシールド（Schwarzshield）対物レンズを用いることもでき、その場合、入射光は、放物面鏡に向かって反射し、当該対物レンズの後方において焦点合わせさせられた環状スポットとなる。]
[0051] 上記例において、本システムは、蛍光検出のために用いられる。但し、本発明は、サンプルの励起及び結果として得られる光の検出により広く関連するものである。誘導されたルミネセンスは、例えば燐光を有することができる。]
[0052] 上記例において、好ましい方策として、ダイクロイックビームスプリッタＤＢＳが用いられる。但し、励起パワーも収集される蛍光も浪費することになるが、普通の（非ダイクロイック）ビームスプリッタを用いることもできる。]
[0053] 基板は、適切な材料の平坦プレートとすることができ、例えば、ガラス又はポリマのものとすることができるとともに、μｍ２当たり０．０１ないし１０６個の、好ましくはμｍ２当たり１０ないし１０４個の面密度を持つ捕捉素子を有するようにしてもよい。]
[0054] サンプル、このサンプルに接触した捕捉素子を持つ基板又は当該サンプルに接触した状態の後の基板は、通常、或る特定の成分、例えば、目標粒子とも呼ばれる、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、蛋白質、炭水化物、脂質、細胞、細胞構成部（外部細胞膜又は内部細胞膜など）、バクテリア、ウィルス、原虫などの生体成分のために検査される。]
[0055] ルミネセント標識は、通常、目標粒子に付され、これにより目標粒子の検出を補助する。したがって幾つかの実施例において、サンプルは、「光学的可変粒子」とも称される少なくとも１つのルミネセント標識を含む。このような光学的可変粒子は、例えば、蛍光（上述したようなもの）、エレクトロルミネセント又は化学ルミネセントの粒子とすることができる。光学的可変粒子は、結合部位に機械的、電気的、化学的又はその他の態様で結合することのできる物体とすることができる。これは、単一分子群又は複数の分子を有し、好ましくは１０ないし１０８個の分子及び／又は量子ドット様標識の群を有するようにしてもよい。複数の分子が用いられる場合、通常は、当該励起に対してより強い応答性が得られ、より良好な信号対雑音比となる。]
[0056] 本発明の用途は、広く分子診断の分野にあり、臨床診断、治療ポイント診断、高性能生体分子診断研究、バイオセンサ、遺伝子及び蛋白質発現アレイ、環境センサ、食品品質センサなどがある。]
[0057] 当業者であれば、様々な他の改変例が明らかとなる。請求項において、括弧内に付された参照符号は、その請求項を限定するものと解釈してはならない。「有する」なる文言は、請求項に挙げられたもの以外の要素又はステップの存在を排除するものではない。要素の単数表現は、かかる要素の複数の存在を排除しない。幾つかの手段を列挙する装置の請求項において、これら手段の幾つかは、同一アイテムのハードウェアにより具現化可能である。或る特定の方策が相互に異なる従属請求項において挙げられているに過ぎない点は、これら方策の組み合わせが活用できないことを意味するものではない。]

权利要求:

請求項1
照射検出システムであって、励起放射線を供給するための励起放射線源及び関連の放射線処理装置と、前記励起放射線をサンプルの分析領域上へ焦点合わせさせるフォーカシング装置と、前記サンプルの前記分析領域からの当該励起に起因した分析放射線を収集する放射線収集装置と、当該収集された分析放射線を検出する検出器と、を有し、当該焦点合わせさせられた励起放射線は、前記サンプルにおいてエバネセントな励起ラインを有する、システム。
請求項2
請求項１に記載の照射検出システムであって、前記放射線処理装置は、環状ビーム形状を発生するためのビーム整形素子を有する、システム。
請求項3
請求項２に記載の照射検出システムであって、前記ビーム整形素子は、前記励起放射線源の出力において平行平面円形断面波面から環状ビーム形状を生成する、システム。
請求項4
請求項２又は３に記載の照射検出システムであって、前記放射線処理装置は、励起ラインに対して前記フォーカシング装置によりマップ化される環状ビームからビーム形状を発生するためのライン形成素子を有する、システム。
請求項5
請求項４に記載の照射検出システムであって、前記ライン形成素子は、前記ライン形成素子と前記フォーカシング装置との間の距離よりも長い焦点距離を有する、システム。
請求項6
請求項４又は５に記載の照射検出システムであって、前記ライン形成素子は、円柱レンズ又は位相板を有する、システム。
請求項7
請求項１ないし６のうちいずれか１つに記載の照射検出システムであって、前記放射線収集装置は、ルミネセンス放射線の形態の分析放射線を収集するためのものである、システム。
請求項8
請求項１ないし７のうちいずれか１つに記載の照射検出システムであって、生体成分スクリーニングシステムを有するシステム。
請求項9
請求項１ないし８のうちいずれか１つに記載の照射検出システムであって、前記フォーカシング装置及び前記放射線収集装置は、励起／収集レンズを共有する、システム。
請求項10
請求項１ないし９のうちいずれか１つに記載の照射検出システムであって、前記検出器は、画素化された光検出器を有する、システム。
請求項11
照射検出システムを用いてサンプルからの分析放射線を測定する方法であって、励起放射線を発生すること、前記励起放射線を処理すること、前記サンプルにおいてエバネセントである励起ラインがサンプルの分析領域において供給されるように当該処理された励起放射線をフォーカシングすること、前記分析領域から前記励起に起因する分析放射線を収集すること、当該収集された分析放射線を検出すること、を有する方法。
請求項12
請求項１１に記載の方法であって、前記分析放射線を収集することは、前記サンプルからルミネセンス放射線を収集することを有する、方法。
請求項13
請求項１１又は１２に記載の方法であって、生物学的要素スクリーニング方法を有する、方法。
請求項14
請求項１１ないし１３のうちいずれか１つに記載の方法であって、前記励起放射線処理は、前記励起放射線源の出力において平行平面円形断面波面から環状ビーム形状を発生することを有する、方法。
請求項15
請求項１４に記載の方法であって、前記励起放射線処理は、前記フォーカシング装置により励起ラインにマップ化される環状ビームからビーム形状を発生するためにライン形成素子を用いることを有する、方法。